一、如何處理收到的細(xì)胞
1.新買的或惠贈(zèng)的細(xì)胞如何處理？
不管買的細(xì)胞、惠贈(zèng)的細(xì)胞，剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測(cè)瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。
2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無(wú)法存活。
3.購(gòu)買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？
常見(jiàn)原因可能有：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過(guò)程錯(cuò)誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于–80℃太久。
二、復(fù)蘇凍存的細(xì)胞
1.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
2.冷凍管應(yīng)如何解凍？
將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。
3.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？
現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會(huì)在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO出去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。
三、細(xì)胞培養(yǎng)用液
1.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？
培養(yǎng)基主要包括天然細(xì)胞培養(yǎng)基、合成細(xì)胞培養(yǎng)基和無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基等。
天然細(xì)胞培養(yǎng)基：是人們?cè)缙诓捎玫募?xì)胞培養(yǎng)基，直接取自于動(dòng)物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然培養(yǎng)基，富含氨基酸。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)基，血清的來(lái)源有胎牛血清、小牛或成牛血清、馬血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和小牛血清。
合成細(xì)胞培養(yǎng)基：是用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽類等。由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成細(xì)胞培養(yǎng)基也不同，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基有6～7 種，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。
無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基：是指在使用中無(wú)需添加血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，且其組成成分不含有任何動(dòng)物組分。按照其組分分類，還可以分為無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和化學(xué)限定無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，前者組分中可能含有某些植物來(lái)源成分，而后者完全由化學(xué)成分明確的組分組成。
其中，無(wú)動(dòng)物組分無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基是目前在生物制藥行業(yè)中應(yīng)用最廣泛的，它提高了細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來(lái)的麻煩。目前，已有多種無(wú)血清培養(yǎng)基上市，如雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基和NS0 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基等。
2.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
3.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲(chǔ)存應(yīng)該注意什么？
細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測(cè)培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號(hào)試用效果良好后，就可一次購(gòu)入較多同一批號(hào)的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營(yíng)養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。
4. 為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會(huì)偏暗紅色？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。
5.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。
6.血清滅活是否必須？
這個(gè)問(wèn)題現(xiàn)在有爭(zhēng)議。有人主張價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長(zhǎng)因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長(zhǎng)達(dá)30分鐘的熱處理會(huì)對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子，氨基酸等成分帶來(lái)的負(fù)面影響。盡管如此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來(lái)執(zhí)行，尤其是在昆蟲細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中。
7.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？
除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
8.何時(shí)更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
四、細(xì)胞傳代
1.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？
根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
2.原代培養(yǎng)的首次傳代應(yīng)注意的問(wèn)題？
細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng)，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷；首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。
3.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？
EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會(huì)。
4.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過(guò)高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
5.細(xì)胞的接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)的重要原因之一。
6.細(xì)胞交叉污染的可能原因？
多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。
五、細(xì)胞凍存
1.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？
因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無(wú)明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高包膜對(duì)水的通透性。
2.DMSO 的等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾的方式為何？
冷凍保存使用的 DMSO 等級(jí)，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無(wú)菌狀況，第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
3.欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x10^6 cells/ml vial 為宜。
4.冷凍保存細(xì)胞的方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。–20 ℃ 不可超過(guò) 1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
5.細(xì)胞凍存太多會(huì)不會(huì)浪費(fèi)？
每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲(chǔ)備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個(gè)狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用應(yīng)凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變。
