#應用指南#
2009 年，Hans Clevers 及其團隊利用 Lgr5+ 腸干細胞在體外培養出了三維小腸類器官結構。這種結構反映了腸上皮細胞的生理狀況，可進行長期體外培養，同時保持細胞分化能力。這種方法越來越多地用于干細胞研究、疾病模型和再生醫學。
小腸類器官既可以用多能干細胞或胚胎干細胞培養，也可以用小腸隱窩干細胞培養。后者由于方便、技術簡單、可多次傳代，可進行長達兩個月的長期體外培養，因此更為常見。
本應用說明重點介紹了 GelNestTM 基質膠在小鼠腸道原代組織類器官培養中的應用。
材料與方法
Part.01
原代小腸組織提取消化
1. 將小鼠安樂死。從回腸末端采集 15 厘米長的腸管。
2. 去除外膜，用冷的 PBS 沖洗。用剪刀剪開腸段，使腸腔朝上。用冰凍 PBS 輕輕清洗剪開的腸段。
3. 在 50 mL 離心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀將腸管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 沖洗。重復清洗步驟，直至清澈為止。
4. 去除上清液，將組織碎片重懸于 25 mL 腸隱窩消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分鐘，然后在 20 rpm 旋轉床上旋轉 30 分鐘。去除上清液。
5. 將組織碎片重懸于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 緩沖溶液中。用 70 μm 過濾器過濾上清液，并將濾液裝入 50 mL 的干凈試管中。重復過濾 3 次，合并濾液。
6. 300×g 離心 5 分鐘。棄去上清液。
7. 將沉淀重懸于 10 mL PBS 緩沖溶液中。200×g 離心 3 分鐘。除去上清液。如果懸浮液中單細胞過多，請重復離心步驟。
Part.02
小腸隱窩計數篩選與接種
1. 取 10 μL 細胞樣本，在顯微鏡下計數隱窩。200×g 離心 3 分鐘，取出上清液。
注：適合培養的隱窩大小不一，通常呈長方形或圓形，邊緣相當光滑，看起來像上皮單層的小的折疊部分。絨毛、單細胞或碎屑濃度較高的部分不是類器官培養的理想選擇。目標是最大程度地富集合適的隱窩。
2. 將隱窩重懸在腸類器官完全培養基中，每微升培養基含 8-20 個隱窩。制作完全培養基時，加入：
3. 取 150 μL 隱窩懸浮液，與等體積未稀釋的 GelNestTM 類器官專用基質膠（NEST 211272）混合，然后輕輕地用移液管上下移動十次，使其充分混合。
4. 將 50 μL 樣品加入預熱好的 24 孔板的每個孔的中心，形成圓頂狀結構。避免形成氣泡。
5. 將平板置于 37℃，靜置 10 分鐘，使基質凝膠凝固。小心處理平板，避免干擾凝膠。
6. 小心地向每個孔中加入 500 μL 室溫（15-25℃）類器官培養基，從側面倒入以避免擾動凝膠。
Part.03
類器官培養與觀察
1. 監測類器官的生長。通常，在培養 3 小時左右，隱窩形成球形結構。2-4 天后，類器官開始出芽，到第5-7 天形成復雜結構。
2. 第二天完全更換培養基。小心去除孔邊緣的舊培養基，加入 500 μL 新鮮的室溫類器官培養基。
3. 定期在倒置顯微鏡下觀察腸類器官并記錄。
4. 選擇合適的抗體對類器官進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察，同時包括適當的特異性對照。
5.使用NEST免費的類器官AI大模型分析軟件進行識別批量、無標記分析由顯微鏡獲取的類器官照片（不限顯微鏡品牌），幫助您更快、更準確的獲得類器官的數量、大小（面積）、圓度、周長、灰度值（可統計熒光照片的不同類器官/細胞球的熒光強度，或明場照片的類器官亮度，從而反應類器官的死活狀態）等參數，并生成統計分析結果。
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實驗結果分析
圖 1. 小鼠小腸類器官在 GelNestTM 基質膠中的生長情況。
在第 2 天在 10 倍物鏡下，可觀察到小型空泡狀結構；在第 3 天可觀察到明顯變大的空泡結構；在第 6 天可觀察到具有多個出芽結構的小腸類器官，且培養皿里的類器官可肉眼直接觀察到白色顆粒狀細胞團。標尺為 200 微米。
圖 2. 早期小腸類器官的細胞骨架蛋白和細胞增殖抗原的免疫染色結果。
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中生長的早期的小腸類器官為單細胞層形成的空泡結構，并且將小腸類器官種在 100 倍稀釋的 GelNestTM 基質膠包被的平皿里，細胞仍然保持有較好的增殖能力（ki67 陽性）。
DAPI 為細胞染料核（藍色）；alpha-Tubulin 為細胞骨架蛋白（紅色）；ki67 為表達于細胞核中的細胞增殖活性的標志物。標尺為 150 微米。
圖 3. 小腸類器官的緊密連接蛋白和上皮細胞特征蛋白的免疫染色結果。
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中（3D）或者在基質膠薄層上（2D）生長的小腸類器官均能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。
DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為 100微米。
圖 4.在 GelNestTM 基質膠中生長 6 天的小腸類器官的緊密連接蛋白和上皮細胞特征蛋白的免疫染色結果。
可觀察到在 GelNestTM 基質膠中（3D）生長的小腸類器官能很好的保持生物功能性細胞標志物的表達。
DAPI 為細胞染料核（藍色）；ZO-1 為細胞緊密連接蛋白標志物（綠色）；CK19 為上皮細胞特征標志物。標尺為100 微米。
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